PCR法、流式细胞法、ELISA法检测HLA-B27的临床对比研究

本研究分别采用PCR法、流式细胞法、ELISA法，对120例强直性脊柱炎（AS）患者和100例正常对照人群进行HLA-B27检测，并对结果进行分析，旨在于对比常用于诊断AS的三种HLA-B27检测方法的各自特点，探讨三种检测方法之间的差异及其优缺点，并为临床检验提供参考依据。结果显示，PCR法、流式细胞法、ELISA法用于检测HLA-B27的敏感性、特异性以及阳性、阴性预测值分别为95.8%、93.0%、94.3%、94.8%；93.3%、95.0%、95.7%、92.2%；83.3%、94.0%、94.3%、82.5%。由此可知，上述三种血清HLA-B27检测方法诊断AS的特异度均较高；且PCR法、流式细胞法的敏感度均显著高于ELISA法，其中PCR法略高于流式细胞法。

正文

人类白细胞抗原B27（HLA-B27）是第6号染色体上HLA基因B座一个等位基因的表达产物，基本表达在机体中所有有核细胞上，淋巴细胞的表面含量尤其丰富。HLA-B27是由Eric Thorsby博士首先于1968年发现的，并于1973年被证明与强直性脊柱炎（AS）关系密切[1-2]。AS是一种主要侵犯脊柱关节及骶髂关节的慢性进行性炎性疾病，好发于青壮年男性，该病诊断的直接证据是X线下脊柱的特征性改变及骶髂关节炎，然而这种改变只有疾病发展到一定的程度才能被观察到[3]。众多试验研究表明，HLA-B27的表达与AS呈高度相关，AS患者中HLA-B27阳性率高达96%以上，而正常人群中仅为4~7%。因此，HLA-B27的检测成为临床诊断与鉴别诊断AS的重要辅助手段[4-7]。

HLA-B27的检测方法有多种，包括补体依赖性微量细胞毒法、玫瑰花法、等电聚焦法以及分子生物学方法等。然而在临床工作中，选择和使用一种简捷、特异、准确的方法检测HLA-B27显得尤为重要。本研究旨在对目前临床上常用的三种HIA-B27检测方法，即实时荧光定量PCR法、流式细胞法、酶联免疫吸附试验ELISA法，进行方法学比较研究。

一、研究对象

AS组选取我院门诊或住院的AS患者120例，其中男88例，女32例；年龄18~45岁，平均31.5岁；均为依据1984年纽约修订的AS诊断标准确诊的患者。

对照组选取同期于我院体检的临床无腰背、关节疼痛或僵硬等症状者100例，其中男性66例，女性34例；年龄19~48岁，平均30.5岁；以上两组患者的一般资料具有可比性。

二、检测方法

1、检测标本制备：

抽取AS组与对照组患者的晨起空腹静脉血4ml于EDTA抗凝管中，编号并注明性别、年龄，24小时内分别采用PCR法、流式细胞法、ELISA法进行HLA-B27检测。

2、检测仪器与操作流程：

①实时荧光定量PCR法：

采用博奥生物有限公司生产的晶芯HLA-B27核酸检测试剂盒，严格按照说明书进行操作，并采用ABI公司的ABI 7500实时荧光定量PCR检测系统进行HLA-B27检测。

②流式细胞法：

每次检测之前均使用校准微球通过FASComp软件对仪器进行校准，采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行检测，HLA-B27荧光抗体F1（FITC）、CD3荧光抗体F2（PE）、校准微球和溶血素均来自BD公司标准试剂盒。检测时严格按照试剂说明进行，将30μl荧光抗体（含抗B27和抗CD3）加入到流式分析专用试管底部，再加入抗凝血50μl，混匀后室温避光15分钟，然后加溶血素2ml，混匀后室温避光10分钟，每分钟1500转离心5分钟，弃上清加PBS液2ml，混匀后每分钟1500转离心5分钟，弃上清加PBS液500μl，混匀后检测。

③酶联免疫吸附试验ELISA法：

采用美国LIFEKEY公司生产的HLA-B27检测试剂盒（批号LE041），将血清作101倍稀释后与系列标准液同时检测，严格按照说明书步骤进行操作，显色后双波长（450/630mm）比色，根据标准品A值和对应浓度绘制的标准曲线查出各测定管浓度，≥35U/ml为阳性，<35U/ml为阴性。

三、统计方法

采用SPSS 15.0软件进行统计学处理，率的比较采用χ²检验，检验水准α=0.05。

四、结果

两组患者的血清HLA-B27表达情况，详见表1。

三种检测方法诊断AS的价值参数，详见表2。

五、讨论

AS好发于青壮年，起病一般较隐匿，早期临床症状较轻，与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等疾病症状相似，且初发者影像学改变不典型，因而在临床诊断上易误诊，失去最佳治疗时机，可导致中、晚期出现不可逆的症状，最后发生关节强直甚至致残。国外临床研究证实，HLA-B27抗原阳性与AS呈高度相关，90%以上的AS患者HLA-B27抗原阳性，而正常人群只有8%表达[8]，HLA-B27因而成为临床诊断与鉴别诊断AS的重要辅助指标。在临床检验工作中，选择和使用一种简捷、特异、准确的HLA-B27检测方法显得尤为重要，可以早期诊断并早期控制患者病情的发展，减轻畸形的发生[9]。

目前临床上常用的HLA-B27检测方法为PCR法、流式细胞法、ELISA法。本研究主要针对上述三种HLA-B27检测方法进行方法学对比研究，探讨三种方法的各自优缺点，为临床检测的选择提供参考依据。本研究结果显示，三种血清HLA-B27检测方法诊断AS的特异度均较高，PCR法和流式细胞法的敏感度均显著高于ELISA法，其中PCR法略高于流式细胞法，这一研究结果与文献报道一致。推测可能是由于PCR法检测的是HLA-B27基因型，而其它血清学检测的是HLA-B27表型，携带HLA-B27基因者细胞表面并不一定有B27抗原表达。因而本研究中PCR法检测为阳性、而流式细胞法及ELISA法测定为阴性的标本，可能与某些AS患者细胞表面HLA-B27抗原并不表达有关。

综上所述，PCR法具有较高的敏感度和特异性，但检测耗时较长，需要特定的检测仪器和严格的检测条件，且检测人员需要取得基因扩增技术上岗证才能参加检测工作；流式细胞法同样具有较高的敏感度和特异性，以及分析速度快、自动化程度高、可消除人为主观因素影响等优点，但仪器价格较昂贵，难以在基层医院进行推广；ELISA法敏感度稍低，采用酶标记多克隆抗体检测血清中HLA-B27抗原，操作快速简单，无需昂贵的设备，较适合基层医院应用。

本文作者为广东医学院附属石龙博爱医院检验科徐炳燕、黎四平、彭琪、梁丽芸、叶俊琴。

参考文献：

[1] Breweton DA, Caffrey M, Hart FD, et al. Ankylosing spondylitis and HLA-B27[J]. Lancet, 1973, 1(13): 904.

[2] Schlosstein L, Terasaki PI, Bluestone R, et al. High association of an HL-A antigen, W27, with ankylosing spondylitis[J]. New Eng J Med, 1973, 288(14): 704.

[3] 高云风. HLA-B27检测应用于强直性脊柱炎的临床意义[J]. 吉林医学, 2012, 33(6): 1164.

[4] 吴娟. 检测强直性脊柱炎患者人类白细胞抗原B27的临床意义[J]. 检验医学与临床, 2013, 10(6): 663.

[5] 刘毓刚, 李琳, 吴丽娟, 等. 流式细胞法检测人类白细胞抗原B27/B7表达在诊断强直性脊柱炎中的价值[J]. 国际检验医学杂志, 2012, 33(2): 138.

[6] 孙芳. 人类白细胞抗原B27检测在临床诊断强直性脊柱炎中的应用价值[J]. 国际检验医学杂志, 2010, 31(11): 1301.

[7] 邹玲莉, 贾妙兴, 常志娟, 等. 流式细胞术检测4272例人类白细胞抗原B27表达的临床意义[J]. 浙江中医药大学学报, 2012, 36(3): 258.

[8] Mcmichel A, Bell J. HLA-B27: a disease-associated immune response gene[J]. Res Immunol, 1991, 142(5-6): 475.

[9] 吴宏. 强直性脊柱炎的X线与CT对比研究[J]. 吉林医学, 2013, 34(23): 4769.